重组腺病毒Ad35-anti-PD-1表达的PD-1抗体增强CTL抗肿瘤功能的研究

【摘要】细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxicTlymphocyte,CTL）是一类自身主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)限制性的抗原特异性的T细胞。因其具有有效靶向杀伤肿瘤细胞的特点，在肿瘤的个体化治疗中占有重要地位。免疫学家希望通过基础研究的突破来提高CTL过继细胞治疗（adoptivecelltherapy,ACT）的临床疗效。幸运的是，随着人们对肿瘤免疫抑制机制研究的不断深入，尤其是免疫检查点（checkpoint）PD-1(programmedcelldeathprotein1)和CTLA4(cytotoxicTLymphocyteAntigen4)的发现，为提高CTL的疗效提供了新思路。PD-1和CTLA4为T细胞活化的负调控蛋白，它们抑制了T细胞活性，降低了T细胞抗肿瘤功能。本课题主要研究了PD-1信号阻断对CTL抗肿瘤功能的影响。首先我们构建了携带PD-1抗体基因的5/35型重组腺病毒载体Ad35-anti-PD-1。然后我们将经PCR鉴定正确的4个病毒克隆感染293细胞，在不同时间点收集细胞上清，通过ELISA实验检测发现3号Ad35-anti-PD-1病毒克隆在72小时PD-1抗体的表达量最高，约600ng/mL。同时Westernbotting证实了表达的PD-1抗体包含正确的重链（约50kD）和轻链（约25kD）。我们选取3号Ad35-anti-PD-1病毒克隆大量表达PD-1抗体，在72h收集细胞上清，用ProteinG亲和层析方法纯化PD-1抗体。考马斯亮蓝染色证实了纯化出的PD-1抗体拥有较高纯度。ELISA实验表明从100mL细胞上清中纯化出的抗体质量约在45μg。经浓缩后，浓度为40μg/mL。最后，我们从人的外周血单个核细胞中分离和培养了DC和T细胞。用重组腺病毒Ad35-TP53感染DC，再用该DC去致敏初始T细胞，获得了TP53特异性的CTL。在CTL杀伤肿瘤细胞的体外实验中，我们设置了加PD-1抗体的实验组和不加PD-1抗体的对照组。采用CCK8试剂盒做出的杀伤数据显示实验组的杀伤效率均高于对照组10个百分点。目前本课题已完成了从Ad35-anti-PD-1重组腺病毒的构建到体外杀伤的部分实验，证明了PD-1抗体体外增强CTL抗肿瘤功能。接下来用Ad35-anti-PD-1感染T细胞，让其分泌PD-1抗体，从而在CTL培养和治疗的不同环节阻断PD-1信号，全面增强CTL的活性，提高CTL过继细胞治疗的疗效。
【作者】陶雷；
【导师】钱其军；
【作者基本信息】浙江理工大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】CTL；PD-1抗体；抗肿瘤；免疫细胞治疗；免疫抑制；

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